O Básico de Fotometria e Espectrofotometria

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Sabia que você pode de fato medir uma cor? O espectrofotômetro é uma ferramenta essencial para biólogos e técnicos da área quando estão analisando amostras biológicas e químicas.

Cor e Luz

Num conceito simples, cores são dependentes diretas da luz. Não vemos as cores de fato, vemos a cor como efeito da luz brilhando sob um objeto. Quando uma luz branca brilha em um objeto, este pode ser refletido, absorvido ou transmitido. O vidro transmite a maior parte da luz que entra em contato com ele, portanto, este parece incolor. A neve reflete toda a luz e aparenta ser branca. Uma roupa preta absorve praticamente toda a luz, assim se torna preta. Muitos objetos parecem ser coloridos porque sua estrutura química absorve certos comprimentos de onda de luz e reflete outros.

Quando estamos discutindo sobre luz, comumente relacionamos à luz branca. Uma fina linha de luz é chamada de raio; um feixe é feito a partir de muitos raios de luz. Quando a luz branca passa através de um prisma (um objeto transparente triangular), as cores que formam a luz branca se dispersam em sete bandas de cor. Sete cores constituem a luz branca, sendo estas: vermelho, laranja, amarelo, verde, azul, índigo e violeta. Em qualquer espectro, as bandas de cores estão sempre organizadas nesta ordem da esquerda para a direita.

Suponhamos que uma luz branca foi emitida em uma substância que absorve luz azul. Sendo o azul o componente da luz branca, este será absorvido pela substância, tornando a luz transmitida mais amarelada, a cor complementar do azul. Esta luz amarela chega em nossos olhos, e nós “vemos” a substância como uma substância amarelada.

A variação de cor de um sistema que sofre uma alteração na concentração de algum componente é a base da análise colorimétrica.

O que é colorimetria?

Colorimetria é a determinação da concentração de uma substância pela medição de absorção relativa de luz, junto de uma concentração conhecida de uma substância. Na colorimetria visual, natural ou artificial, a luz branca é comumente usada como fonte de luz, e suas determinações são realizadas com um instrumento chamado colorímetro ou comparador de cor. Quando o olho simulado é simulado por uma célula foto elétrica, o instrumento é chamado de colorímetro fotoelétrico.

A quantidade de radiação absorvida é dada através da Lei de Beer-Lambert:

A = Ɛ · l · C

A    é a Absorbância

Ɛ é o coeficiente molar [L/(mol·cm)]

l     é o comprimento (cm)

C     é a concentração (mol/litro)

Fotômetro vs Espectrofotômetro

Fotômetro

Um fotômetro isola um comprimento de onda específico de luz usando filtros. Um colorímetro usa filtros de banda de borda, ou algum sistema semelhante, para separar a luz em componentes de cor e ajustá-los às curvas correspondentes baseadas no olho humano, para produzir valores de cor com base no que o olho humano veria. Isso é ideal para corresponder à resposta visual humana, mas não informa nada sobre dados invisíveis ao olho humano, como picos emissivos em pontos altos do espectro; isto são dados espectrais e requerem um espectrofotômetro.

Espectrofotômetro

Espectrofotômetros são diferentes de fotômetros, pois estes permitem a medição no espectro de todos os comprimentos de onda de luz visíveis e não apenas ondas pré-especificadas. Espectrofotômetros quebram a luz em um espectro, utilizando uma grade de difração ou um sistema similar. Então uma matriz de sensores lê cada seção do espectro, produzindo dados espectrais. Isto é ideal se você estiver analisando emissões espectrais de uma lâmpada, uma estrela, ou alguma outra fonte de luz. Por isso espectrofotômetros são frequentemente usados como dispositivos científicos.

Configurações Ópticas de um Espectrofotômetro

Feixe Simples

Em um espectrofotômetro convencional de feixe único, o branco e a amostra são medidos consecutivamente, com um intervalo de vários segundos para uma medição de comprimento de onda único e até vários minutos para uma medição de espectro total com um instrumento convencional. O desvio de funcionamento da lâmpada pode resultar em erros significativos durante longos intervalos de tempo.

Feixe Duplo

O Espectrofotômetro duplo, ou de feixe duplo, foi desenvolvido para compensar estas mudanças na intensidade da lâmpada entre as medições no branco e nas cubetas de amostra. Nesta configuração, uma fonte de luz emite um feixe de luz único no qual é dividido por uma espécie cortador de luz, criando dois feixes de igual energia com caminhos ópticos iguais. Passando um feixe através da referência enquanto o outro feixe passa através da amostra.

Comparando com espectrofotômetros de feixe único, os instrumentos de feixe duplo contêm mais componentes ópticos, o que reduz a taxa de transferência e a sensitividade. Para alta sensitividade, medições mais demoradas são necessárias. Além disso, um design mecânico mais complexo de um espectrofotômetro pode resultar em uma piora em sua confiabilidade.

Feixe Divido

O espectrofotômetro de feixe dividido se assemelha ao espectrofotômetro de feixe duplo, mas usa um divisor de feixe em vez de um cortador, para assim enviar a luz por um longo tempo para a medição branca e à amostra simultaneamente. para dois detectores separados, mas idênticos. Essa configuração permite que o espaço em branco e a amostra sejam medidos ao mesmo tempo. O projeto de feixe dividido é mecanicamente mais simples do que o verdadeiro instrumento de feixe duplo e requer menos elementos óticos.

O espectrofotômetro de feixe dividido se assemelha ao espectrofotômetro de feixe duplo, entretanto utiliza um divisor de feixe ao invés do cortador, para assim enviar a luz para a medição branca e a amostra simultaneamente, utilizando dois detectores separados, mas idênticos. Esta configuração permite que a medição branca e a amostra sejam medidas ao mesmo tempo. O mecanismo de feixe dividido é mecanicamente mais simples que o instrumento de feixe duplo e requer menos elementos ópticos.

Melhores Usos para um Espectrofotômetro

Hoje, os espectrofotômetros são projetados para serem duráveis e portáteis, oferecendo maior flexibilidade de uso. Suas aplicações são inúmeras, entretanto, algumas das mais requisitadas são:

  • Determinação elementar para qualidade da água
  • Análise enzimática em vinho
  • Análise de propriedades de fertilizantes para agricultura

Estas são apenas alguns dos usos potenciais para um espectrofotômetro.

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